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    【文獻熱點】值得警惕的外顯測序雷區4:變異類型識別局限性(嵌合體/單外顯CNV/大Indel/ Alu

    發布時間 :2021-07-09 13:02 閱讀 :
    雷區4:變異類型識別局限性(嵌合體/單外顯CNV/大Indel/ Alu 插入變異)

    1、嵌合體的識別

    與特定臨床表型相關的嵌合體變異很容易識別,但是當缺乏明顯的特異性表型,尤其是患者的臨床表現與該基因非嵌合情況下的臨床表現有較大差異時,識別潛在的嵌合體變異是一個很大的臨床挑戰。一項研究[1]對不同系統、不同適應癥的患者(總計12,000例樣本)的外顯子測序(ES)結果進行統計后發現,約1.5%的先證者存在與表型相關的致病性嵌合體變異,0.3%的親代樣本中存在與先證者表型相關的嵌合體突變。在常規的ES中,捕獲芯片更加側重于覆蓋基因的廣度而不是測序的深度,如果沒有額外的驗證實驗,可能會遺漏潛在的嵌合體變異。

    圖1 隊列SNV檢測選擇策略

    2、單外顯CNV

    外顯子測序準確檢測 CNV 的能力對于基因診斷和對基因功能研究都至關重要,而檢測外顯子水平,特別是單個外顯子,需要更深測序深度,同時要最大限度地減少假陽性而同時識別所有的真陽性,這無疑是一個巨大的技術挑戰。同時需要依靠快速準確識別CNV 的算法,以提高單個外顯子檢測的特異性和靈敏度[2]。

     

    一項研究[3]對3010份臨床上進行外顯子測序的案例進行了數據重分析,樣本平均測序深度為123.3X,在臨床相關的 CNV 水平上,總體靈敏度為98.7%,盡管如此,依然未能檢測到單個外顯子的小的 CNV。這個問題的解決需要用更高的測序深度以達到更小的 CNV 分辨率,同時需要保證目標區域有較好的探針覆蓋度。

     

    圖片

    圖2 研究的分析流程

     

    3、大 Indel

    外顯子測序能夠輕松檢測SNV和小插入缺失(Indel)。然而,涉及外顯子缺失/重復和染色體重排的基因組變化需要對捕獲的 NGS 數據進行更仔細的分析,因為當 Indel的大小接近或大于NGS 讀長時,NGS讀取可能無法正確對齊參考序列。對捕獲區域的富集以及深度測序能夠避免由于 PCR 引物或二級 DNA 結構中的 SNP 導致的等位基因丟失,以達到同時檢測點突變和基因內外顯子缺失的能力[4]。

     

    4、Alu插入變異

    基于捕獲區域的富集和高深度測序,能識別目標基因中大量的缺失和插入,一項研究[5]中使用平均測序深度為1000x的捕獲測序,用于無關的視網膜色素變性(RP)患者的臨床分子診斷,能夠識別靶基因中的外顯子缺失和插入,診斷率高達82%(53/65),其中包括了Alu序列的插入和深度內含子變異。如此高診斷率的結果,源于全面的目標區域覆蓋、高深度測序、外顯子水平覆蓋均一性以及100%的靈敏度和特異性[5]。
     
    圖片

    圖3 9個隨機選擇的樣本中平均覆蓋率與覆蓋率低于20倍的CDS數量之間的關系測序深度的提高對于減少未充分覆蓋區域數量以及提高變異調用的準確性至關重要)

     

    但基于捕獲的外顯子測序依然有其局限性,通常在具有高GC含量的外顯子或具有重復序列的區域或基因組其他部分具有高度同源序列的區域中具有低覆蓋率。因此,為了實現這些區域的100%覆蓋,需要PCR或Sanger驗證。

     

    參考文獻:

    [1] Cao Y, Tokita MJ, Chen ES, Ghosh R, Chen T, Feng Y, Gorman E, Gibellini F, Ward PA, Braxton A, Wang X, Meng L, Xiao R, Bi W, Xia F, Eng CM, Yang Y, Gambin T, Shaw C, Liu P, Stankiewicz P. A clinical survey of mosaic single nucleotide variants in disease-causing genes detected by exome sequencing. Genome Med. 2019 Jul 26;11(1):48. doi: 10.1186/s13073-019-0658-2. PMID: 31349857; PMCID: PMC6660700.

    [2] Chiang T, Liu X, Wu TJ, Hu J, Sedlazeck FJ, White S, Schaid D, Andrade M, Jarvik GP, Crosslin D, Stanaway I, Carrell DS, Connolly JJ, Hakonarson H, Groopman EE, Gharavi AG, Fedotov A, Bi W, Leduc MS, Murdock DR, Jiang Y, Meng L, Eng CM, Wen S, Yang Y, Muzny DM, Boerwinkle E, Salerno W, Venner E, Gibbs RA. Atlas-CNV: a validated approach to call single-exon CNVs in the eMERGESeq gene panel. Genet Med. 2019 Sep;21(9):2135-2144. doi: 10.1038/s41436-019-0475-4. Epub 2019 Mar 20. PMID: 30890783; PMCID: PMC6752313.

    [3] Sun Y, Ye X, Fan Y, Wang L, Luo X, Liu H, Gao X, Gong Z, Wang Y, Qiu W, Zhang H, Han L, Liang L, Ye H, Xiao B, Gu X, Yu Y. High Detection Rate of Copy Number Variations Using Capture Sequencing Data: A Retrospective Study. Clin Chem. 2020 Mar 1;66(3):455-462. doi: 10.1093/clinchem/hvz033. PMID: 32031585.

    [4] Wang J, Yu H, Zhang VW, Tian X, Feng Y, Wang G, Gorman E, Wang H, Lutz RE, Schmitt ES, Peacock S, Wong LJ. Capture-based high-coverage NGS: a powerful tool to uncover a wide spectrum of mutation types. Genet Med. 2016 May;18(5):513-21. doi: 10.1038/gim.2015.121. Epub 2015 Sep 24. PMID: 26402642.

    [5] Wang J, Zhang VW, Feng Y, Tian X, Li FY, Truong C, Wang G, Chiang PW, Lewis RA, Wong LJ. Dependable and efficient clinical utility of target capture-based deep sequencing in molecular diagnosis of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 Aug 5;55(10):6213-23. doi: 10.1167/iovs.14-14936. PMID: 25097241.

     

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