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    【文獻熱點】值得警惕的外顯測序雷區2:NGS/外顯測序的技術局限性(測序深度/覆蓋率)

    發布時間 :2021-06-25 13:41 閱讀 :

    雷區2:NGS/外顯技術局限性(覆蓋深度/覆蓋率)

    不同的測序平臺之間的數據質量存在差異。相關研究對比了Complete Genomics和Illumina HiSeq全基因組和全外顯子組測序的錯誤率下限邊界。根據平臺和測序深度的不同,非參考序列的基因型檢測錯誤率從0.1%到0.6%不等。Complete Genomics測序平臺的數據錯誤率明顯高于Illumina測序平臺,尤其是對于某些罕見或特殊的變異,其錯誤率更高(高達6%),而Illumina錯誤率隨著數據測序深度的增加而減少,因此我們在解讀下一代測序(NGS)相關檢測結果時應更加謹慎,尤其是在沒有其他更可靠的測序或基因分型方法驗證的情況下,在臨床應用該技術時更是如此[1]。

     

    除此之外,外顯子測序對于某些疾病的診斷也存在局限性,如龐貝病。相關研究分析了93例確診龐貝病患者的WES數據以及通過PCR/ Sanger測序分析了GAA的基因型,對患者基因型和表型及全外顯檢測結果一致性進行評估。通過WES檢測使用標準生物信息學方法分析,在42/93(45%)的患者中檢測到了GAA基因的兩個致病性變異;但是在42/93(45%)的患者中一個GAA致病性變異(GAA內含子c.-32-13T>G)被遺漏并且在9/93(10%)的患者中未發現GAA致病性變異[c.1195-19_2190-17del(p.Asp399fs*6)以及18號外顯子缺失](表1,[2])。

     

    表1  經標準 WES 分析流程漏掉的突變

     

    同樣,在對一個由近親生育的3名非綜合征性聽力障礙兒童的家庭的研究中,GIPC3基因的c.508C>A(p.H170N)和 ZNF57 的 c.1328C>T(p.T443M)的雙基因組錯義純合變異可導致常染色體隱性非綜合征型感音神經性耳聾。但由于測序深度不夠深,GIPC3中一種新的錯義突變在分析過程中最初被過濾掉導致出的結論是ZNF57是唯一的潛在致病基因(表2,[3])。

     

    表2  單倍型譜系,聽力敏度圖以及檢出的兩個變異.(A)與表型共分離的家系和19號染色體上第三長的自系純合(autozygous)區域;(B)家庭中受累成員的聽力圖;(C)ZNF57 (p.T443M)的野生型、純合子型和雜合子型Sanger 測序圖;(D)GIPC3 (p.H170N) 的野生型、純合子型和雜合子型 Sanger 測序圖

     

    因此,對于WES檢測,我們需要注意到WES雖然能夠對基因的外顯子區域進行測序,但是這種檢測手段仍然存在局限性。使用外顯子組測序進行臨床診斷時需要認識到普遍存在的基因片段缺失/重復或內含子的致病性變異,以及外顯子組測序在臨床相關基因組位置的測序深度和覆蓋率不足的可能性,而這些可能會導致全外顯子組測序結果假陰性[4]。提高測序深度到200x以上可以顯著降低局限性和提高檢出率。

     

     

    參考文獻:

    [1] Wall Jeffrey D,Tang Ling Fung,Zerbe Brandon et al. Estimating genotype error rates from high-coverage next-generation sequence data.[J] .Genome Res, 2014, 24: 1734-9.

    [2] Mori Mari,Haskell Gloria,Kazi Zoheb et al. Sensitivity of whole exome sequencing in detecting infantile- and late-onset Pompe disease.[J] .Mol Genet Metab, 2017, 122: 189-197.

    [3] Sirmaci Asli,Edwards Yvonne J K,Akay Hatice et al. Challenges in whole exome sequencing: an example from hereditary deafness.[J] .PLoS One, 2012, 7: e32000.

    [4] Gotway Garrett,Crossley Eric,Kozlitina Julia et al. Clinical Exome Studies Have Inconsistent Coverage.[J] .Clin Chem, 2020, 66: 199-206.

     

     

     

     

     

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