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    【文獻熱點】值得警惕的外顯測序 雷區1:基因組的特殊區間局限性(高GC/同源區間)

    發布時間 :2021-06-18 13:58 閱讀 :

    隨著高通量測序技術的發展,外顯子組測序越來越多地應用于科學研究與臨床診斷。但是,外顯子組測序依然存在一些局限性,如 GC 含量、捕獲效應、變異識別的局限性等因素都可能影響外顯子測序的準確性和敏感性,接下來我們將作出一個系列來探討這些值得警惕的外顯子測序雷區,提醒大家不要“踩雷”。

     

    雷區1:基因組的特殊區間局限性(高GC/同源區間)

    本期,我們分享基因組上的特殊區間,如高GC區間、同源區間,導致的全外顯子測序局限性。
     

     

    通過評估三個不同的平臺(NimbleGen CapSeq V2, Agilent SureSelect V2 和 Illumina TruSeq)生成的 WES 數據中覆蓋率,發現全外測序覆蓋度不均勻的特點,這種覆蓋度的不均勻性既包括局部的(同一外顯子在不同平臺上的覆蓋率不同),也包括全局的(不同測序平臺上的所有外顯子的覆蓋率不同)。低覆蓋率或者說覆蓋差的區域可能含有重要功能的基因,并且通常與高 GC 含量、重復單元和片段重復相關。雖然與 WES 相關的大多數問題都是由于捕獲方法的局限性,但 WES 技術需進一步改進以提高其臨床應用 [1]。

     

    基因組序列中,存在很多用 Sanger 或 NGS 方法難以或無法分析的區域。這些區域的存在證實了整個人類外顯子組的高同源性的普遍特征(表1,[2])。

     

    表1. NGS “死亡區域”(dead zone)(2.2%的外顯子;619個基因): 這些區域是完整的外顯子或與其他基因座100% 相同的外顯子的大的連續部分; Sanger “死亡區域”(dead zone): 外顯子組中不能使用標準短擴增子的方法進行 Sanger 測序的區域。

     

    對于某些高度同源的區域,WES 檢測存在很大的局限性,例如 ADPKD,WES 在檢測 PKD1 外顯子1-32 突變時,該特異區域的檢測靈敏度僅為7.14%。通過評估WES、WGS 和靶向富集法檢測 PKD1 和 PKD2 基因 ADPKD 突變的有效性,結果顯示與 WGS 和靶富集陣列相比,在 ADPKD 患者中,WES 檢測到 PKD1 突變的敏感性為50%,WES 檢測到 PKD1 重復區域(外顯子1-32)的測序深度和測序質量較低[3]。

     

    另一個典型的同源區域影響 NGS 檢測與分析的案例是編碼β型微管蛋白的基因 TUBB2A。微管蛋白(tublins)和微管聚合物,通過影響細胞增殖、神經元遷移和遷移后發育,在哺乳動物大腦皮層發育過程中發揮關鍵作用。β型微管蛋白基因 TUBB2A 變異導致嬰兒期癲癇伴簡化腦回,文獻中提及 WES 數據初次判讀并未找到致病變異,后經重分析才獲取變異信息。這是由于該變異所在序列高度保守,對應的氨基酸殘基形成的肽環(T7環)在 α 和 β 微管蛋白家族中高度保守(圖1, [4])。

     

    圖1:T7環(框內)是高度保守的,不僅在β微管蛋白同型之間,而且在整個 α 和 β 微管蛋白家族(保守的殘基用星號表示)。

     

    目前的 NGS 屬于短讀長測序,且依賴于 PCR 反應過程。高 GC 含量的區域不易擴增,導致覆蓋度低,通過優化實驗過程和提高測序深度等方法可以在一定程度上改觀。同源序列的存在無疑會為組裝過程和讀取變異帶來困難,在對外顯子進行測序時,要格外重視基因組中同源序列的影響,必要時采取其他技術手段,例如采用長片段 PCR 結合 NGS 的方法(LR-PCR+NGS)進行檢測。后者已經在 ADPKD 或 21-OHD 等同源基因檢測中獲得成熟應用。

     

    參考文獻:

    [1]  Wang Q, Shashikant CS, Jensen M, Altman NS, Girirajan S. Novel metrics to measure coverage in whole exome sequencing datasets reveal local and global non-uniformity. Sci Rep. 2017 Apr 13;7(1):885. 

    [2]  Gotway G, Crossley E, Kozlitina J, Xing C, Fan J, Hornbuckle C, Thies J, Michel D, Quinn C, Scheuerle AE, Umana LA, Uhles CL, Park JY. Clinical Exome Studies Have Inconsistent Coverage. Clin Chem. 2020 Jan 1;66(1):199-206.  

    [3]  Ali H, Al-Mulla F, Hussain N, Naim M, Asbeutah AM, AlSahow A, Abu-Farha M, Abubaker J, Al Madhoun A, Ahmad S, Harris PC. PKD1 Duplicated regions limit clinical Utility of Whole Exome Sequencing for Genetic Diagnosis of Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease. Sci Rep. 2019 Mar 11;9(1):4141.

    [4]  Cushion TD, Paciorkowski AR, Pilz DT, Mullins JG, Seltzer LE, Marion RW, Tuttle E, Ghoneim D, Christian SL, Chung SK, Rees MI, Dobyns WB. De novo mutations in the beta-tubulin gene TUBB2A cause simplified gyral patterning and infantile-onset epilepsy. Am J Hum Genet. 2014 Apr 3;94(4):634-41. 

     

     

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